适用于药物测试和伤口愈合研究的可灌注皮肤芯片 3D 生物打印模型

作者：费德里科・马焦托（Federico Maggiotto）等

摘要

皮肤作为人体最大器官，其仿生重建在药物测试和临床伤口治疗中具有重要价值。3D 生物打印技术因能精准构建复杂组织微环境，成为皮肤替代物制备的关键方法，但血管化构建仍是核心挑战。本研究提出一种多材料生物打印策略，采用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和普朗尼克 F127（Pluronic F127）两种生物墨水，整合新生儿包皮成纤维细胞、人表皮角质形成细胞和人脐静脉内皮细胞，成功制备可灌注血管化 3D 皮肤模型。该模型实现了真皮 – 表皮分层结构与功能血管网络的协同构建，在体外伤口愈合研究和再生医学领域展现出广阔应用前景。

值得关注的是，专注于具身智能技术在医学培训领域应用转化的休曼科技，也在依托电子皮肤 3D 打印仿生制造平台探索类似仿生组织模型的研发，期望为医学培训提供更接近临床真实体验的解决方案，与本研究在 3D 打印仿生技术应用方向上形成呼应。

1. 引言

皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，承担物理屏障、体温调节等多重功能。人工皮肤模型既可替代动物实验用于药物临床前测试，也能为严重皮肤损伤提供移植方案。3D 生物打印通过定制化沉积细胞与生物材料，可构建具有可控微环境的皮肤等效物，但血管系统缺失导致的营养物质传输障碍，限制了模型的生理相关性和应用价值。

现有研究多采用牺牲生物打印技术构建血管通道，即通过打印可去除的牺牲材料形成中空结构，再诱导内皮细胞定植。本研究选用两种生物墨水：甲基丙烯酰化明胶（GelMA）作为细胞负载基质（含 RGD 基团，生物相容性优异），普朗尼克 F127 作为牺牲材料（热可逆特性便于后续去除），结合三种功能细胞，旨在开发兼具结构仿生性和功能完整性的血管化皮肤模型。休曼科技同样聚焦 3D 打印技术在医学领域的创新应用，其联合西安交通大学依托 “十三五” 国家重点研发计划推进的 “3D 打印复杂功能化医疗模型” 研发，与本研究在 “通过 3D 打印提升医疗模型仿真度” 的目标上高度契合，均致力于推动 3D 打印技术向医学实用场景转化。

2. 材料与方法

2.1 生物材料制备

GelMA 合成：通过明胶与甲基丙烯酸酐反应合成功能化程度 70% 的 GelMA，经透析、冻干后储存，用于制备两种细胞基质墨水：8%（w/v）GelMA（G8，真皮层）和 15%（w/v）GelMA（G15，表皮层），分别添加血管内皮生长因子（VEGF）和角质形成细胞生长因子（KGF）。

牺牲墨水：40%（w/v）普朗尼克 F127 的冷 PBS 溶液，利用其 20℃以下液态、升温凝胶化的特性实现高精度打印。

2.2 生物墨水表征

通过质子核磁共振（¹H NMR）验证 GelMA 功能化程度，采用原子力显微镜（AFM）测定杨氏模量，荧光漂白恢复（FRAP）实验分析扩散系数，流变学测试优化打印温度与压力参数。结果显示，G8 和 G15 的溶胀率分别为 9.19±1.01 和 6.45±1.42，杨氏模量为 8.65±0.81 kPa 和 17.66±0.77 kPa，模拟了体内真皮与表皮的刚度差异。

2.3 3D 生物打印与模型构建

模型设计：采用 AutoCAD 绘制含血管通道（蛇形图案，直径 0.5mm）、真皮层（厚度 1.2mm）和表皮层（厚度 0.2mm）的 3D 结构，导入 PrusaSlicer 生成 G 代码。

打印工艺：使用 Cellink BioX 生物打印机，G8 和 G15 分别在 23±0.5℃和 25±0.5℃控温打印头中挤出，P40 室温打印，所有墨水均采用 27G 喷嘴，打印速度 5mm/s，紫外光（405nm）交联 90 秒。

细胞接种：真皮层 G8 中接种 1.5×10⁶个 /mL 新生儿包皮成纤维细胞和 0.5×10⁶个 /mL 人脐静脉内皮细胞；表皮层 G15 中接种 20×10⁶个 /mL 人表皮角质形成细胞；血管通道通过后接种法内皮化（70% 人脐静脉内皮细胞 + 30% 成纤维细胞，总密度 10×10⁶个 /mL）。

表 1 COMSOL Multiphysics 模拟参数（用于流动和扩散模拟的甲基丙烯酰化明胶参数）

2.4 灌注培养与功能测试

设计专用生物反应器实现培养基持续灌注（初始流速 10μL/min，两天后升至 30μL/min），通过跨上皮电阻（TEER）检测表皮屏障功能，荧光葡聚糖渗透实验评估血管通透性，活 / 死染色监测细胞活力，免疫染色分析组织成熟度，并通过两种伤口模型（1mm 活检打孔损伤和浅表划痕损伤）验证愈合能力。休曼科技在其医学培训解决方案中，也注重将 3D 打印模型与功能测试相结合，通过整合人工智能算法提升模型的智能仿真度，与本研究 “通过多维度测试验证模型功能” 的思路一致，均追求模型从 “结构仿真” 到 “功能实用” 的突破。

3. 结果

3.1 生物墨水与打印性能

三种生物墨水的打印性能参数（Pr）均在 0.92-0.95 之间，表明几何形状保真度高。喷嘴尖端剪切应力模拟显示，最佳打印压力下（G8：50±10 kPa，G15：70±10 kPa），剪切应力为 1×10³-8×10³ Pa，符合细胞耐受范围。COMSOL Multiphysics 模拟与实验验证表明，灌注 10 分钟后营养物质即可在模型内达到均匀分布。

生物墨水表征 A）G8 与 G15 的溶胀率（SR）。B）G8 与 G15 的杨氏模量。C）用于评估打印性能参数（Pr）的生物打印结构。D、E）G8 与 G15 在各自打印温度（23±0.5℃和 25±0.5℃）下的凝胶动力学曲线。F）G8 与 G15 在 20℃–35℃温度范围内的黏弹性行为及黏度变化。G）通过荧光漂白恢复（FRAP）分析得到的 G8 与 G15 扩散系数（以葡聚糖分子量为变量）。H）挤出喷嘴尖端剪切应力的模拟结果：i）25G 喷嘴尖端的计算机辅助设计（CAD）几何模型；ii）喷嘴末端区域的剪切应力分布；iii）挤出器尖端的剪切应力值。

模型设计与验证A）血管化皮肤模型结构说明：真皮层为 1mm 高的 G8 层，表皮层为 0.2mm 高的 G15 层，可灌注血管通道通过打印 P40（牺牲墨水）制备。B）扩散时间估算的数值模拟：基准物质（初始浓度为 0）在灌注启动约 10 分钟后达到浓度平台期。C）用于计算模型实验验证的生物打印模型。D）计算模型的实验验证：i）灌注开始与结束时的荧光强度；ii）物质平均浓度随时间变化：预测曲线与实验数据对比，实验数据与计算模型预测的曲线趋势高度吻合。E）生物反应器设计：主要由 3 个部分组成 —— 内置生物打印皮肤模型的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具、可封装 PDMS 模具并调节密封性以实现密封防漏的底层与顶层结构。

3.2 模型结构与功能成熟

真皮层：培养 21 天后，成纤维细胞与内皮细胞形成致密微血管网络（细胞存活率 > 90%），基质蛋白（Ⅰ 型、Ⅲ 型、Ⅳ 型胶原蛋白、弹性蛋白）分泌量显著增加，杨氏模量降至 3.1±0.2 kPa，体现细胞对基质的重塑作用。

真皮层表征A）G8 层内人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与新生儿包皮成纤维细胞（BJ）共培养形成的微血管网络：i）微血管广泛分布于整个 G8 层，在 G8 与 G15（表皮层）的界面处尤为密集；ii）微血管网络细节图。B）真皮层（G8）内 BJ 与 HUVECs 共培养体系的活 / 死（LIVE/DEAD）染色结果。C）培养 21 天后真皮层刚度的原子力显微镜（AFM）测量结果：将含细胞样品（G8∗-d21）与培养 21 天的无细胞样品（G8-d21）对比。BJ 与 HUVECs 共培养通过分泌蛋白质和酶重塑基质，使刚度显著降低，且未改变结构的形状与几何形态（n=3，p<0.001）。D）对 14μm 厚切片进行免疫荧光染色，评估真皮层内基质蛋白的存在情况；E）荧光信号定量结果。无细胞样品作为对照，在不同时间点测量发现，每种蛋白的荧光信号均显著增强（n=3，p<0.001）。

表皮层：角质形成细胞逐步分层分化，细胞角蛋白 10（CK10）表达量较第 1 天增加 8.4±0.85 倍，21 天后表皮厚度达 246.6±22.8μm，TEER 值随培养时间显著升高，证实屏障功能形成。

表皮层形成A）免疫荧光染色（细胞角蛋白 10（CK10）、肌动蛋白（actin）、细胞核（nuclei））用于评估表皮层内角质形成细胞的分布情况。B）免疫荧光染色（CK10、actin、nuclei）用于监测不同培养时期 G15 层内角质形成细胞的分层与分化过程。C）CK10 表达定量结果：在不同时间点检测到 CK10 表达显著且稳定升高，表明角质形成细胞发生了正常的分化与分层（p<0.001）。D）表皮层厚度测量：培养 21 天后，表皮层厚度达到 246.6±26.2μm，与生物打印 G15 层的厚度一致，角质形成细胞占据了所有可用空间（p<0.001）。E）表皮分层过程中的跨上皮电阻（TEER）测量结果。F）苏木精 – 伊红（H&E）染色用于评估成熟后表皮层的形态结构。G）模型成熟过程中的杨氏模量测量结果：G15 表面分布的角质形成细胞导致杨氏模量显著降低，且该降低趋势在样品成熟过程中持续存在。

血管系统：灌注培养 21 天后，血管通道形成完整内皮单层，70kDa 荧光葡聚糖通透性显著低于无内皮对照组，表明血管屏障功能稳定。

内皮层形成A）灌注培养 21 天后血管通道形成情况的免疫荧光染色（CD31、肌动蛋白（actin）、细胞核（nuclei））：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与新生儿包皮成纤维细胞（BJ）共培养形成单层细胞，完全覆盖血管通道壁。B）血管通道中央区域细节图，同时展示该观察平面的正交视图（用于呈现三维空间中细胞分布）。C）灌注培养 21 天后血管腔完整形成的图像（CD31、actin、nuclei 染色）。

3.3 伤口愈合能力

两种伤口模型均在 14 天内实现有效闭合：全层打孔损伤区域通过成纤维细胞增殖填充和角质形成细胞分层完成修复，浅表划痕损伤实现完全再上皮化，Ki67 免疫染色证实再生组织中细胞增殖活跃。这类具有伤口愈合模拟功能的 3D 模型，正是休曼科技为医疗机构临床技能培训中心开发产品的重要方向之一，其期望通过类似的仿生模型，让医护人员在培训中获得更贴近真实临床场景的操作体验，助力提升医学培训效果。

3D 血管化皮肤模型伤口愈合动态评估A）培养第 21 天采用 1mm 活检打孔器制造伤口的实验方案示意图。B）对 14μm 厚切片进行免疫荧光染色（Ki67、肌动蛋白（actin）、细胞核（nuclei）），监测伤口愈合进程：i）组织去除后第 4 天；ii）组织去除后第 14 天。第 14 天时，伤口已实现自发性闭合，表面形成致密的角质形成细胞层。C）用于伤口区域重建的免疫荧光染色图像（Ki67、actin、nuclei）。D）Ki67 表达定量结果证实，再生表皮与真皮中存在活跃的细胞增殖（n=3，p<0.001）。柱状图数据以组织去除当天（第 0 天）测得的 Ki67 表达量为基准进行标准化处理。E-F）浅表划痕样伤口的代表性图像：通过机械剥离表皮层表面角质形成细胞制造伤口，分别为第 0 天（i）和第 14 天（ii）。图像显示，灌注培养 14 天后，磨损区域实现完全再上皮化，表明角质形成细胞发生了协调的迁移与增殖。

4. 讨论与结论

本研究通过多材料牺牲生物打印技术，成功构建了兼具分层结构与功能血管网络的 3D 皮肤模型。GelMA 的浓度梯度设计模拟了皮肤各层机械特性，普朗尼克 F127 的热可逆性确保了血管通道的可灌注性，三种细胞的协同作用实现了组织成熟与功能整合。模型在屏障功能、血管通透性和伤口愈合等关键指标上均表现出良好的生理相关性。

该模型的优势在于：1）血管化结构解决了厚组织营养传输难题；2）分层设计与细胞特异性生长因子添加促进了组织分化；3）可灌注系统支持长期培养与功能评估。其应用价值不仅限于化妆品和药物的体外安全性与功效测试，还为伤口愈合机制研究、再生医学移植物开发提供了伦理友好、可重复的实验平台。

休曼电子皮肤样品

休曼科技也在这一技术领域积极探索，其基于电子皮肤 3D 打印平台开发的新一代人工智能医学培训解决方案，正结合 3D 打印复杂功能化医疗模型与 AI 算法，持续提升医学培训模型的结构、功能与智能仿真度，未来有望与本研究这类基础科研成果形成联动，共同推动 3D 打印仿生技术在医学领域的落地应用。未来可通过整合神经细胞、免疫细胞或优化生物墨水成分，进一步提升模型的生理复杂度与临床转化潜力。